Penyakit genetik masih menjadi cabaran global, kerana ia disebabkan oleh mutasi gen yang menjejaskan fungsi biologi, proses metabolik, atau pengeluaran protein penting tertentu individu, kepada pelbagai gangguan yang diwarisi. Ubat terapi gen ialah sejenis intervensi terapeutik yang menyasarkan gen tertentu, bertujuan untuk membaiki atau mengubah suainya, dan memberikan arahan baharu untuk sel menghasilkan protein berfungsi atau campur tangan dalam kecacatan gen yang menyebabkan penyakit.
Ubat gen biasa terutamanya termasuk DNA dan RNA, di mana DNA boleh menjadi serpihan gen atau urutan gen dengan kesan terapeutik. DNA ini dihantar ke sel untuk menggantikan atau menambah fungsi gen yang rosak atau hilang. RNA boleh menjadi messenger RNA (mRNA), RNA interfering kecil (siRNA), atau antisense oligonucleotides (ASO), dsb., yang boleh digunakan untuk mengubah suai, menghalang ekspresi gen berbahaya, atau memulihkan fungsi gen tertentu.
Walau bagaimanapun, kedua-dua DNA dan RNA menghadapi banyak cabaran daripada memasuki tubuh manusia hingga mencapai sel sasaran. Oleh kerana urutan gen tidak stabil dalam saluran gastrousus, ia biasanya diberikan melalui suntikan intravena atau subkutan, tetapi walaupun begitu, kebanyakan jujukan gen masih terdegradasi oleh nuklease yang banyak dalam tubuh manusia.
Apabila sejumlah kecil sisa ubat gen sampai ke luar sel sasaran, mereka tidak boleh memasuki sel kerana jujukan gen ialah molekul besar dengan kumpulan fosfat membawa cas negatif, manakala membran sel juga membawa cas negatif. Apabila dua cas negatif bertemu, gen ditolak dan tidak boleh memasuki sel. Oleh itu, kita perlu membangunkan kaedah penyampaian ubat gen khusus untuk mengelakkan kemerosotannya dalam vivo dan meningkatkan kecekapan penembusan membran sel, dan menyampaikan urutan DNA atau RNA ke sel dengan lancar.
Kaedah Penghantaran untuk Ubat Gen
Kaedah penghantaran gen biasa semasa terbahagi terutamanya kepada dua kategori: penghantaran vektor virus dan penghantaran vektor bukan{0}}viral. Penghantaran vektor virus terutamanya termasuk adeno-virus berkaitan (AAV) dan lentivirus, dsb., yang boleh mensimulasikan proses jangkitan virus sel hos dan mudah merentas halangan sel, sekali gus mencapai kecekapan penghantaran yang tinggi. Walau bagaimanapun, penghantaran vektor virus juga mempunyai masalah: pertama, ia mempunyai kapasiti pembungkusan terhad, seperti kapasiti pembungkusan maksimum AAV ialah 4.7kb, yang tidak dapat menyampaikan urutan gen yang lebih panjang; kedua, vektor virus boleh menyebabkan tindak balas imun yang serius, termasuk imuniti selular dan imuniti humoral, menimbulkan risiko untuk aplikasi klinikal. Berbanding dengan itu, vektor bukan-virus mempunyai kelebihan besar dalam keselamatan dan kapasiti memuatkan dadah.
Vektor bukan virus yang biasa digunakan semasa-terutamanya termasuk liposom, polimer, zarah nano, eksosom, dsb., antaranya liposom ialah vesikel yang dibentuk oleh molekul amfifilik dengan diameter antara 100nm hingga 1um. Mereka terutamanya terdiri daripada fosfolipid, kolesterol, lipid PEG dan lipid kationik. Struktur dwilapisan fosfolipid adalah serupa dengan membran sel dan boleh memasuki sel dengan lancar melalui endositosis. Di samping itu, liposom juga boleh mengubah suai PEG atau antibodi khusus pada permukaannya untuk melarikan diri dari pelepasan imun badan sambil menyasarkan tisu atau sel tertentu. Liposom kationik ialah liposom yang mengandungi lipid garam ammonium kuaterner yang bercas positif, yang boleh mengikat lebih baik dengan ubat asid nukleik bercas negatif dan mengekalkan kestabilan sistem penghantaran. Oleh itu, liposom ialah salah satu kaedah penghantaran vektor bukan{9}}viral yang biasa untuk ubat gen.
Walau bagaimanapun, liposom tradisional juga mempunyai beberapa masalah: pertama sekali, disebabkan oleh rentang diameter liposom yang besar, walaupun ini dapat memastikan kapasiti pemuatan ubat yang mencukupi, apabila liposom melepasi jurang endothelial vaskular (100-200nm), saiz yang terlalu besar akan menghalang proses ini. Di samping itu, selepas liposom memasuki sel melalui endositosis dan membentuk sistem endosom-lisosom, liposom tradisional tidak dapat menyelesaikan pelepasan lisosom dalam masa, mengakibatkan kebanyakan ubat gen didegradasi oleh lisosom dan tidak dapat memberikan kesannya. Berdasarkan kelemahan liposom tradisional ini dalam menyampaikan ubat gen, nanopartikel lipid (LNP) telah dibangunkan dan menjadi kaedah penyampaian penting terutamanya sesuai untuk menghantar asid nukleik ke sel dan tisu sasaran.
Pengenalan kepada Sistem Pembawa LNP
Lipid nanopartikel (LNP) ialah nanozarah yang terdiri daripada{0}}bahan seperti lipid dan diameter umumnya antara 10-200nm. Berbanding dengan liposom tradisional, ia lebih kecil dan lebih mudah melalui celah endothelial vaskular. Selain itu, LNP biasanya terdiri daripada lipid kationik/boleh terion, fosfolipid tambahan, lipid polietilena glikol (PEG) dan kolesterol. Antaranya, fosfolipid tambahan dan kolesterol boleh meningkatkan kestabilan LNP; Lipid PEG membantu meningkatkan masa edaran LNP dalam vivo dan mengurangkan tindak balas imun. Komponen ini mempunyai fungsi yang sama seperti liposom tradisional. Perbezaannya terletak pada lipid kationik/boleh terionisasi, yang juga merupakan kawasan utama perlindungan paten untuk LNP.
Seperti yang dinyatakan sebelum ini, liposom kationik boleh mengekalkan pengikatan dengan ubat asid nukleik dengan berkesan dan meningkatkan kecekapan penghantaran ubat asid nukleik. Walau bagaimanapun, liposom kationik juga terdedah kepada pengikatan bukan{1}}spesifik dengan protein plasma bercas negatif, sel darah, dsb. dalam peredaran badan, menyebabkan pengagregatan liposom dan disingkirkan dengan cepat daripada badan (separuh-hayat liposom kationik dalam vivo hanya 15 minit).
Untuk menyelesaikan masalah ini, penyelidik telah membangunkan jenis bahan lipid baru yang dipanggil lipid terion. Lipid terion sangat mirip dengan lipid kationik dalam struktur. Mengambil DOTAP lipid kationik biasa dan DODAP lipid boleh terion sebagai contoh, perbezaannya ialah DOTAP ialah garam ammonium kuaterner dengan cas positif, manakala DODAP ialah struktur amina tertier. Struktur amina tertier boleh mengekalkan pKa lipid antara 6-7. Apabila pH lebih rendah daripada pKa (dalam keadaan berasid), lipid boleh terion bercas positif.
Apabila pH hampir dengan pKa (di bawah keadaan neutral), lipid boleh terion adalah neutral. Reka bentuk ini boleh menyelesaikan masalah yang dihadapi oleh liposom kationik dengan bijak: memandangkan pH dalam peredaran darah hampir kepada neutral, lipid boleh terion juga neutral, dan pengikatan tidak-spesifik antara mereka dan protein plasma atau sel darah berkurangan dengan ketara, memanjangkan separuh hayat{-nya. Di samping itu, apabila LNP lipid boleh terion diambil oleh sel dan memasuki lisosom, lipid terion dan bercas positif dalam persekitaran lisosom dengan pH 5-6. Lipid bercas positif mudah bercantum dengan membran endosom-lisosom, membolehkan liposom melarikan diri ke sitoplasma, berpisah dan membebaskan asid nukleik, dengan itu memberikan kesannya. Secara ringkasnya, mereka bentuk sistem pembawa LNP melibatkan pengoptimuman komposisi lipid, saiz zarah, cas permukaan dan kestabilan untuk mencapai penghantaran gen yang cekap.
Strategi Bioanalisis LCMS untuk Ubat Gen berpaket-LNP
Ubat gen berbungkus LNP-terutamanya terdiri daripada cengkerang LNP dan ubat gen itu sendiri. Cangkang LNP terutamanya terdiri daripada komponen lipid (lipid kationik/boleh terionisasi menyumbang kira-kira 30-50%, lipid PEG menyumbang kira-kira 2%, kolesterol menyumbang kira-kira 20-50%, fosfolipid tambahan menyumbang kira-kira 10-20%), manakala ubat gen terutamanya terdiri daripada serpihan jujukan gen (DNA dan miRNA, dll. siRNA). Mengikut peraturan terkini NMPA dan FDA[14-15], untuk aplikasi IND bagi ubat sistem penyampaian ubat seperti LNP, selain menjalankan kajian farmakologi dan farmakokinetik pada bahan aktif (jujukan gen), penilaian keselamatan dan farmaseutikal juga diperlukan untuk komponen lipid baharu yang belum digunakan dalam ubat yang dipasarkan dalam sistem penghantaran/pengionan lipid yang khusus, seperti lipid yang boleh diubah suai. LNP.
Bioanalisis LCMS lipid LNP memfokuskan pada lipid kationik/boleh terion dan lipid PEG. Disebabkan oleh perbezaan struktur antara mereka, berat molekul lipid kationik/boleh terion secara amnya adalah dalam lingkungan 1 kDa, manakala berat molekul lipid PEG boleh mencapai 2~5 kDa selepas membawa kumpulan pengubahsuaian, mengakibatkan perbezaan besar dalam pengekalan kromatografi dan tindak balas spektrometri jisim antara mereka. Memandangkan kandungan lipid kationik/boleh terion dalam LNP adalah lebih tinggi daripada lipid PEG, perbezaan tindak balas membawa kepada ketidakupayaan untuk menyatukan kaedah prarawatan dengan berkesan (pemilihan pelarut pengekstrakan, penentuan faktor pencairan) kedua-duanya. Di samping itu, disebabkan kehadiran banyak puncak yang mengganggu di sekitar kedudukan puncak lipid PEG, kecerunan pemisahan fasa cecair yang lebih panjang sering diperlukan untuk pemisahan yang berkesan, yang tidak dapat menjamin kecekapan analisis yang tinggi. Oleh itu, kami secara berasingan mewujudkan kaedah pengesanan lipid PEG dalam bioanalisis. Pada masa yang sama, lipid kationik/boleh terion dan lipid PEG juga mempunyai kesukaran biasa dalam pembangunan kaedah kerana komponen lipidnya, seperti keterlarutan yang lemah dalam air, ketidakstabilan dalam matriks biologi, pengikatan protein kepada pemulihan yang melebihi had, gangguan tinggi dan sisa lipid PEG, perubahan kestabilan lipid dalam matriks sampel sebenar dan kesukaran dalam pemilihan standard dalaman.
